不久，袁术派其堂弟袁胤取代周尚任丹阳太守，周瑜随周尚到了寿春（今安徽寿县）。袁术发现周瑜有才，便欲收罗周瑜为已将。周瑜看出袁术最终不会有什么成就，所以只请求做居巢县长，欲借机回江东，袁术同意了周瑜的请求。
建安三年（198年），周瑜经居巢回到吴郡（今江苏苏州）。孙策闻周瑜归来，亲自出迎，授周瑜建威中郎将，调拨给他士兵两千人，战骑五十匹。此外，孙策还赐给周瑜鼓吹乐队，替周瑜修建住所，赏赐之厚，无人能与之相比。孙策还在发布的命令中说：“周公瑾雄姿英发，才能绝伦，和我有总角之好，骨肉之情。在丹阳时，他率领兵众，调发船粮相助于我，使我能成就大事，论功酬德，今天的赏赐还远不能回报他在关键时刻给我的支持呢！”周瑜时年二十四岁，吴郡人皆称之为周郎。
因庐江一带，士民素服周瑜的恩德信义，于是孙策命他出守牛渚、后来又兼任春谷长。不久，孙策欲取荆州，拜周瑜为中护军，兼任江夏（治湖北新州西）太守，随军征讨。周瑜、孙策攻破皖城，得到桥公两个女儿，皆国色天姿。孙策自娶大乔，周瑜娶小乔。（注：大乔、小乔本姓桥，后桥、乔二姓不分，都作乔，通称二乔。演义中为了抬高二桥身份，把她们的父亲叫做乔国老。）孙策对周瑜说：“桥公之女，虽经战乱流离之苦，但得我们二人作女婿，也足可庆幸了。”（策自纳大桥，瑜纳小桥。策从容戏瑜曰：“桥公二女虽流离，得吾二人作婿，亦足为欢。也有说法，流离做光彩焕发貌讲。）
接着进攻寻阳，败刘勋，然后讨江夏，又回兵平定豫章（今江西南昌）、庐陵。周瑜留下来镇守巴丘。
建安五年（200年），孙策遇刺，临终把军国大事托付孙权。时孙权只有会稽、吴郡、丹阳、豫章、庐陵数郡，其偏远险要之处也尚未全附。天下英雄豪杰散在各个州郡，他们只注意个人安危去就，并未和孙氏建立起君臣之间相互依赖的关系。关键时刻，首先出面支持孙权的是张昭、周瑜、吕范、程普等人。周瑜从外地带兵前来奔丧，留在吴郡孙权身边任中护军。他握有重兵，用君臣之礼对待孙权，同长史张昭共同掌管军政大事，其他人自然不敢有异议异动。
曹操在官渡之战打败袁绍后，兵威日盛，志得意满，以为天下可运于掌。于是，在建安七年（202年），下书责令孙权，让他把儿子送到自己这里来做人质。孙权亦是人英，当然不愿如此受制于人，便召集群臣会商。臣下众说纷纭，张昭、秦松等重臣，犹豫再三，不能决断。
孙权本意虽不想送人质，但由于没有得到强有力的支持，也有点举棋不定。于是，他只带周瑜一人到母亲面前议定此事。周瑜立场坚定，坚决反对送人质，他给孙权分析利害说：“当年楚君刚被封到荆山之侧时，地方不够百里。他的后辈既贤且能，扩张土地，开拓疆宇，在郢都建立根基，占据荆扬之地，直到南海。子孙代代相传，延续九百多年。现在将军您继承父兄的余威旧业，统御六郡，兵精粮足，战士们士气旺盛。而且，铸山为铜，煮海为盐，人心安定，士风强劲，可以说所向无敌，为什么要送质于人呢？人质一到曹操手下，我们就不得不与曹操相呼应，也就必然受制于曹氏。那时，我们所能得到的最大的利益，也不过就是一方侯印、十数仆从、几辆车、几匹马罢了，哪能跟我们自己创建功业称孤道寡相提并论呢？为今之计，最好是不送人质，先静观曹操的动向和变化。如果曹操能遵行道义，整饬天下，那时我们再归附也不晚；如果曹操骄纵，图谋生乱，那么玩兵如玩火，玩火必自焚，将军您只要静待天命即可，为何要送质于人呢？”
周瑜这番话，说到了孙权心里。孙权的母亲也认为该这样做，她对孙权说：“公瑾的话有道理，他比你哥哥只小一个月，我一向把他当儿子对待，你该把他当成兄长才是。”孙权便没给曹操送人质。
周瑜越来越得孙权的信赖，而他也越发竭诚尽智，为孙氏集团的崛起奔波劳碌，不辞辛劳，说得上忠贞不二。《江表传》记载，曹操曾派人去游说，想使周瑜为自己所用，所派的人是九江蒋干。蒋干仪容过人，很有才气，善于辩说，江淮人士，无人能比。这次受命后，他头戴葛巾，身着布衣，装作闲游，去见周瑜。周瑜猜出了他的来意，出来迎接，劈头便问：“子翼真是用心良苦，居然远涉江湖，不是来替曹操来做说客的吧？”蒋干被周瑜开口便道破机关，颇为尴尬。勉强自解：“我和您本是州里乡亲，这次来，不过是来拜访您，顺便看看您的部队罢了。您却说我是说客，岂不过分？”周瑜笑道：“我虽不及夔与师旷，称不上知音，但闻韶赏乐，足知雅曲。”言下之意，你的心理，我是清清楚楚。于是请蒋干进入营帐，摆设酒宴，盛情款待，酒罢，对他说：“我有军机密事，您先到外面客馆住下，等事办完，我去请您。”三天之后，周瑜又把蒋干请人营中。这次，先领着他遍观军营，检视仓库和军资器仗，然后，仍然置酒高会。席间，周瑜向蒋干展示了自己的侍从、服饰珍宝，并对他说：“丈夫处世，遇知己之主，外托忠臣之义，内结骨肉之亲，言行计从，祸福共之。即使苏、张更生，郦叟复出，犹抚其背而折其辞，岂足下幼生所能移乎！”周瑜既已表示得十分坚决，蒋干也就无话可说，只好微笑。蒋干回见曹操，对曹操说，周瑜器量端雅，趣致高卓，言词说他不动。天下之士，因此愈加佩服周瑜。
建安十一年（206年），周瑜率孙瑜等讨麻、保二屯，斩其首领，俘万余人。江夏太守黄祖遣部将邓龙率数千人入柴桑，周瑜率军击之，生俘邓龙。
曹操基本统一北方后，进而想统一全国，第一个战略目标便是荆州。时刘备中原逐鹿失败，正寄居在荆州刘表那里。孙权也早看中了荆州之地。建安十三年（208年）春，孙权讨江夏，周瑜为前部大督都，打败了盘踞在那里的黄祖。
曹操恐孙权占了先手，在同年九月，大举挥师南下。时刘表病死，刘琮不战而降。刘备力孤，无法与曹操争衡，率众南逃。
曹操顺利占领荆州，收降刘琮的八万人马，拥有大军数十万，实力陡增，骄横益甚。扬言要顺流而下，席卷江东。行前，曹操写信给孙权，信中说：“我奉旨南征，刘琮束手就擒。如今我训练了大军八十万，准备与您会猎江东。”
在这严重的局势面前，东吴的谋臣将士十分惊恐。孙权召集他们商讨对策，以张昭为首的大部分人都认为应该“迎曹”。他们说：“曹公豺虎也，然托名汉相，挟天子以征四方，动以朝廷为辞，今日拒之，事更不顺，且将军大势可以拒操者，长江也。今操得荆州，奄有其地。刘表治水军，蒙冲斗舰，乃以千数，操悉浮以沿江，兼有步兵，水陆俱下。此为长江之险，已与我共之矣。而势力众寡，又不可论。愚谓大计不如迎之”只有鲁肃等少数人力主“抗曹”，然而不足以扭转局势。鲁肃建议孙权把周瑜从外地召回。
周瑜一归来，便力挽狂澜。他针对“迎曹”派的观点向孙权指出：“不然。操虽托名汉相，其实汉贼也。将军以神武雄才，兼仗父兄之烈，割据江东，地方数千里，兵精足用，英雄乐业，尚当横行天下，为汉家除残去秽。况操自送死，而可迎之耶？请为将军筹之：今使北土已安，操无内忧，能旷日持久，来争疆场，又能与我校胜负于船楫，可乎？今北土既未平安，加马超、韩遂尚在关西，为操后患。且舍鞍马，仗舟揖，与吴越争衡，本非中国所长。又今盛寒，马无藁草。驱中国士众远涉江湖之间，不习水土，必生疾病。此数四者，用兵之患也，而操皆冒行之。将军擒操，宜在今日。瑜请得精兵三万人，进住夏口，保为将军破之。”（《三国志&；#8226；吴书&；#8226；周瑜鲁肃吕蒙传》）
孙权闻言大喜，对周瑜说：“老贼欲废汉自立久矣，陡忌二袁、吕布、刘表与孤耳。今数雄已灭，惟孤尚存，孤与老贼，势不两立。君言当击，甚与孤台，此天以君授孤也。”（《三国志&；#8226；吴书&；#8226；周瑜鲁肃吕蒙传》）
当夜，周瑜为了坚定孙权的信心，消除他的疑虑，又单独进谒。他对孙权说：“大臣们一见曹操的战书上写有水步兵八十万，心中恐惧，也不认真推测一下虚实，就提出了降敌的见解，这是没道理的。现在，我们可以认真地估算一下，曹操所带的中原士兵，最多十五、六万，而且是经过长途跋涉、疲惫不堪之众；收降刘表的人马，最多不过七、八万，而且这部分人尚心怀观望、怀疑，并未一心一德。曹操统御着这些疲惫病弱、狐疑观望的士兵，人数虽多，何足畏惧？我们只要有精兵五万就完全可以战胜他。请您不要迟疑，不要有所顾忌。”
孙权听了，大受感动，拍着周瑜的背说：“公瑾之言，大合我心！张昭等人，顾惜家人妻小，只为小我考虑，真让我失望。只有你与鲁肃的看法跟我一致，这是老天让你们二人来辅助我的！五万人，一时难以凑全。但我已选好三万人马，船只粮草和各种战具也已准备妥当，你和鲁肃、程普马上就可以带兵出发。我会继续调发人众、粮草，做你的后援。你能一战破曹，当然好，假如遇到挫折，就回来找我，我将与曹操决一死战！”
时刘备欲率军渡江，与鲁肃在当阳相遇，共图计策，刘备于是进住夏口，派诸葛亮谒见孙权，孙权与刘备遂结成联盟，共同抗曹。
孙权任命周瑜为左督，统军三万。程普为右督，鲁肃为赞军校尉，协助周瑜。周瑜和刘备部队会师，沿江而上，与曹军在赤壁相遇。曹军新到江南，不服水土，疾病流行，士气低落。刚一接战，立即败退，只好驻扎在江北，想等冬天过后，第二年春天再战；周瑜所部，初战获胜，士气振奋，驻扎在南岸。
曹营将士，好多人不习水性，为了克服这一弱点，曹操下令把战船用铁索锁在一起，上面铺上木板，连接成水上营寨，以便利行走。他自以为得计，称这些船为连环船。看到这种情况，周瑜部下老将黄盖献计：“今寇众我寡，难与持久。然观操军船舰，首尾相接，可烧而走也。”（《三国志&；#8226；吴书&；#8226；周瑜鲁肃吕蒙传》）周瑜认为黄盖说得有理。便选蒙冲斗舰数十艘，里面装满柴草，浇上油脂，外面用帐幕包裹，插上牙旗，做好火攻的准备。
黄盖先派人送信给曹操，信中说：“我世受孙氏厚恩，地位待遇本不低卑，但是，为人当识时务。孙氏要用江东六郡山越之人与中原百万之众对抗，众寡悬殊，胜负已定。江东士吏，不分贤愚，均知此理。只有周瑜、鲁肃执意如此。”他还在信中表示：“交锋之日，盖为前部，当因事变化，效命在近。”
周瑜选择了一个刮东南风的夜晚，命令黄盖带领数十艘战船（每一战船后拖一只小船，以备放火人员后退时使用），乘风向曹营进发。曹军以为黄盖真来投降，毫不防备，只是指点观看。船队行到距离曹军水寨一里左右，黄盖下令各船同时点火。“时风盛猛，悉延烧岸上营落。顷之。烟炎张天，人马烧溺死者甚众，军遂败退，还保南郡。”（《三国志&；#8226；吴书&；#8226；周瑜鲁肃吕蒙传》）曹操留曹仁守江陵，自己返回北方。
周瑜又与程普进军南郡，和曹仁隔江相持。两军尚未交锋，周瑜先派甘宁前去占据夷陵。曹仁分出一部分兵马包围了甘宁，甘宁向周瑜告急。周瑜采用了吕蒙的计谋，留下凌统守卫后方，亲带吕蒙去救甘宁，解除了甘宁之围。周瑜率兵屯驻北岸，约定日期大战曹仁。周瑜亲自骑马督战，被飞箭射中右胁，伤势严重，退兵回营。曹仁闻周瑜卧病在床，亲自督帅士兵上阵攻击吴兵。周瑜奋身而起，巡视各营，激励将士，用命杀敌，曹仁只好退走。
孙权任命周瑜为偏将军，兼仁南郡太守，并把下隽、汉昌、刘阳、州陵作为他的奉邑，让他屯兵于江陵。
赤壁之战，中国统一过程暂告中断，三足鼎立局面已露端倪，周瑜则声威大震，名扬天下。
赤壁战后，刘备以左将军领荆州牧，已乘机攻占了武陵、长沙、零陵、桂阳四郡，驻在公安。刘表旧部多附刘备。刘备为了进一步扩大地盘，到京口去见孙权，以江南四郡地少，不能安民为理由，请求孙权把南郡借给他，使他得以控制荆州地区的局面。
周瑜上疏给孙权，疏中说：“刘备以枭雄之姿，而有关羽、张飞熊虎之将，必非久屈为人用者。愚谓大计宜徙备置吴，盛为筑宫室，多其美女玩好，以娱其耳目，分此二人，各置一方，使如瑜者得挟与攻战，大事可定也。今猥割土地以资业之，聚此三人，俱在疆场，恐蛟龙得云雨，终非池中物也。”（《三国志&；#8226；吴书&；#8226；周瑜鲁肃吕蒙传》）
但孙权认为曹操在北方势力太大，应该广泛招揽英雄人物才能与之抗衡；而刘备又绝非可以轻易制服之人，所以，没有采纳周瑜的建策。
周瑜扼制刘备的计谋未被采用，很不甘心，于是又向孙权献上另一计策。时刘璋任益州牧，张鲁不断生事滋扰。周瑜对孙权说：“今曹操新折衄，方忧在腹心，未能与将军连兵相事也。乞与奋威俱进取蜀，得蜀而并张鲁，因留奋威固守其地，好与马超结援。瑜还与将军据襄阳以蹙操，北方可图也。”（《三国志&；#8226；吴书&；#8226；周瑜鲁肃吕蒙传》）
周瑜这一计划，非常有战略眼光。孙权当即表示同意。周瑜想赶回江陵，做出征的准备工作。半途染病，死于巴丘（今湖南岳阳。一说死庐陵巴丘，今峡江县巴邱镇），死时年仅三十六岁。
《江表传》载周瑜临终前给孙权的上疏曰：“瑜以凡才，昔受讨逆殊特之遇，委以腹心。遂荷荣任，统御兵马，志执鞭弭，自效戎行。规定巴蜀，次取襄阳，凭赖威灵，谓若在握。至以不谨，道遇暴疾，昨自医疗，日加无损。人生有死，修短命矣，诚不足惜。但恨微志未展，不复奉教命耳。方今曹公在北，疆场未静，刘备寄寓，有似养虎，天下之事未知终始，此朝士旰食之秋，至尊垂虑之日也。鲁肃忠烈，临事不苟，可以代瑜。人之将死，其言也善，倘或可采，瑜死不朽矣。”虽短短篇幅，却足以写尽对东吴一生的忠诚。透过这篇遗言，我们不难看出其智虑筹谋之深远，以及文采之出类拔萃。
周瑜一死，孙权感到痛折股肱。于是，亲自穿上丧服为他举哀，感动左右。周瑜的灵柩运回吴郡时，孙权到芜湖亲迎，各项丧葬费用，全由国家支付。
周瑜墓建于建安十五年（210年）。墓地面积约5亩，兆域高约8尺，有封无表，平地起坟，汉砖砌成，墓门向东，墓周绕以石刻栏杆，旁建木质六角“谈笑亭”。历经千年，冢塌亭倒。凡经修陵园总面积扩大到8648平方米。
周瑜一生征战，有强烈的进取精神和横行天下的报负；周瑜少年得志，风度可人，议论英发，有口皆碑；周瑜文采超群，精于音乐，即使是酒后，仍能听出乐人演奏的音乐中的很细微的疏失，每当这时，他总要转头看一看。所以当时有谣谚说：“曲有误，周郎顾。”（《三国志&；#8226；吴书&；#8226；周瑜鲁肃吕蒙传》）
周瑜待人谦恭有礼。当时孙权只是将军，诸将及宾客对他礼仪并不全备，比较草率。只有周瑜对孙权敬慎服事，完全按君臣之礼来对待。
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